Terapia Genica Cheat Sheet

È un organo molto adatto alle applic­azioni di terapia genica. Perché:
è facilmente access­ibile
presenta una struttura anatomica molto compar­tim­ent­ali­zzata che consente la sommin­ist­razione locale di vettori, ed è un sito immuno­-pr­ivi­legiato. Questo perché, anche nel caso in cui il soggetto presen­tasse Ab anti-AAV, nell’o­cchio i vettori non sarebbero non sarebbero eliminati.
esistono molti modelli animali facilmente reperibili (Cane mutato RPE65).
Il vettore AAV, sommin­istrato in via intra-­vit­reale (nel bulbo ottico) è capace di trasdurre le cellule gangli­onari della retina che poi arrivano al cervello.
Invece è possibile inserire nello spazio sotto-­ret­inico la siringa per la sommin­ist­razione dei vettori AAV trasdu­cendo i fotore­cettori e cellule intermedie (epitelio pigmen­tato).
 
La terapia genica ha riscontro per:
Amaurosi congenita di Leber: è una retinite pigmentosa in cui coni e baston­celli degene­rano. Quando la luce colpisce la rodopsina, la reazione che stimola il nervo ottico è irreve­rsibile => dev'­esserci un turnover dei dischi che avviene per fagocitosi da parte delle cellule dell’e­pitelio pigmentato retinico. Poi saranno sostituiti da nuovi dischi che arrivano in superf­icie.
Meccanismo di fagocitosi inattivo: => fotore­cettore degenera. La cosa inizia a livello dei baston­celli ( che sono più sensibili a causa dell’alto turnover dei dischi) restri­ngendo il campo visivo fino alla cecità. Dal punto di vista istologico vi è un assott­igliato dello strato dei recettori, con perdita dell’i­ntero recettore. Terapia nell'uomo: AAV RPE65 iniezione sotto-­ret­inica. Si vedono miglio­ram­enti.
Retino­schisi: Difetto genetico per cui le 2 metà della retina non si fondono perfet­tamente e si hanno bolle a livello sotto-­ret­inico. Approccio classico di terapia genica: rilascio di una proteina mutata (RS1).
Coroid­oid­remia: Difetti nel gene REP1 (Rag Escort Protein 1). Si ha assott­igl­iamento della retina => degene­razione della retina, trattata con un vettore AAV-REP1.
Cecità: per ristab­ilire la visione si stimolano dirett­amente le cellule gangli­onari della retina. Qui si usa l'optoge­netica che converte le cellule gangli­onari della retina in fotore­cettori trasfe­rendo i geni delle proteine sensibili alla luce.
Age Macular Degene­ration, AMD: La zona della macula e della fovea può degenerare per patologie diverse:
1) Forma secca: Atrofia dei recettori. Forma meno grave e più frequente.
2) Forma umida:Dovuta a neo-va­sco­lar­izz­azione retinica, data da iperpr­odu­zione di VEGF, in cui i vasi sanguigni invadono la macula => non funzionano bene in quanto iper-p­erm­eabili e causano edema, emorragie e cecità. Forma più rara e più grave, anche in progre­ssione. Terapie:
Aptameri: Macugen lega il VEGF a 165 ammino­acidi e lo blocca, con iniezione intra-­vit­reale.
MAb anti-VEGF:Lucentis, legante tutte le forme di VEGF, con iniezione intra-­vit­reale.
Avastin: sviluppato per tumori al colon, costa meno del Lucentis e ha lo stesso effetto.
Cellule staminali embrionali: molto dibattute perchè portano a teratomi.

Le CVDs compre­ndono una serie di patologie comprendo:
ICTUS,
ISCHEMIE DEGLI ARTI INFERIORI: claudi­catio, insuff­icienza trofica da irrora­zione => comparsa di ferite che non guaris­cono, gangrena franca.
MALATTIE ISCHEMICHE, come la cardio­mio­patia ischemica: occlusione di un vaso. Le placche che si formano non necess­ari­amente occludono il vaso ma limitano il flusso di sangue in modo costante. Per riaprire il vaso si usa un palloncino che si rigonfia. Ma c'è compli­canza da RESTENOSI: processo a livello della tunica media in cui si ha un aumento della prolif­era­zione che porta alla richiusura del vaso. Si risolve con stent medicati insieme a rapamicina che bloccano la prolif­era­zione, associati ad antico­agu­lanti.

ANGIOG­ENESI formazione di vasi sanguigni in tessuti adulti, avviene in venule post capillari: Sprouting. Come avviene?
Il VEGF (o FGF) induce la degrad­azione della membrana basale del vaso preesi­stente e le cellule migrano formando un tubo primitivo che va verso la sede di produzione del VEGF (conce­ntr­azione più alta). Questo vaso primitivo è formato da 2 tipi di cellule endote­liali:
1. tip cells sul fronte d’inva­sione del vaso, non prolif­erano, sentono il gradiente chemio­tattico e tramite noch signaling inducono il differ­enz­iamento delle cellule vicine in stock cells.
2. stock cells altamente prolif­era­tive.
Quindi il neo-vaso subirà rimode­lla­menti: smette di prolif­erare quando incontra altre cellule che lo rendono indipe­ndente da VEGF e regolano la direzi­onalità di crescita.
Poi matura grazie a: angiop­oie­tine, PDGF-B, TGF-β.
Delivery di VEGF a livello del cuore per via:
intrav­enosa
intrac­oro­narica
Dirett­amente nel cuore dall’e­ndo­cardio o dall’e­sterno
Intrap­eri­cardico per trattare cardio­patia ischemica.
Periva­scolare (rilascio di VEGF attorno ai vasi).
Iniezione nel al seno corona­rico.
Negli arti inferiori:
Iniezioni multiple intram­usc­olari degli arti inferiori
Intrar­terioso

Terapia Genica Obbiettivi:
1. Indurre neo-an­gio­genesi delle aree del miocardio normal­mente non ri-vas­col­ari­zzabili con le metodiche classiche.
2. Cardio protection, dei cardio­miociti vivi.
3. Rigenesi del miocardio.

Terapia per la Neo Angiog­enesi
Uso di biofar­maci: smallRNA o miRNA; proteine ricomb­inanti => sicure ma non efficaci in pazienti con CHD (Chronic heart Disease) e PAOD (Ischemia perife­rica). Perchè?
⚠ Per formare un vaso stabile servono almeno 14/30 giorni in cui è attiva­mente presente VEGF => emivita in vivo insuff­ici­ente. Non si hanno problemi di mutagenesi inserz­ionale, tipica dei vettori retrov­irali.
VEGF come plasmide nudo o con Adenovirus iniziale risposta positiva => Fase 2 non funziona!. In adenovirus => risposta infiam­matoria elimina le cellule trasdotte!
Vettori AAV: Si usa VEFG sotto controllo di promotore tet on/off e doxici­clina in vivo per 30 giorni: VEFG è espresso, i vasi si formano e restano anche se poi spegniamo il gene.

Distrofia muscolare: altera­zione delle proteine del complesso DGC che coinvolge la distrofina proteina con peso di 427kDa; 2,4 Mbp di cui la coding region 11kbp.
Due forme cliniche: DMD e DMB.
DMD: proteina tronca o instabile quindi non funzio­nante. terapia: Cortic­ost­eroidi per alleviare i sintomi.
BMD: delezione dei siti centrali della distrofina senza compro­mettere i domini N-t (che lega l'ac­tina) e C-t ( Che lega il complesso DGC). Qui la distrofina è più piccola ma funzio­nante: patologia meno grave della DMD.
Terapia Genica: Trasforma la DMD in DMB. però il gene della distrofina è molto grande e ci sono problemi a inserirlo intera­mente.
Vettore di scelta: AAV, anche se piccolo => produzione di una distrofina più piccola: Mini- distrofine (6kbp) e Micro-­dis­trofine (4kbp) con entrambe N-t e C-t.

Vettore di scelta: AAV.
Obbiettivi: contro­llare i sintomi; promuovere la rigene­razione e soprav­vivenza dei neuroni; o rimpia­zzare la funzione del gene mancante.
Fattori Neurot­rofici:
Nurotr­ofine: NGF (Nerve Growth Factor), BDGF (Brain Derived Growth Factor), NeuroT­rofine 3 e 4. Legano recettori Tyr-ki­nasici o TRK sulla membrana dei neuroni. Questi si associano in eterod­ime­riz­zazione con un altro recettore della stessa famiglia: p75. Ognuno dei Trk può legare uno dei membri delle neurot­rofine, mentre tutti sono in grado di legare il recettore p75.
Famiglia di GDNF (Glial Drived Neurot­rophin Factor): GDNF, neurot­urina (NTN), artemina (ART), persefina (PSP).
Famiglia del CNTF/LIF (Celialy Derived Neurot­ophic Factors e Leukemia Inibitory factor).
 
Alzheimer: Atrofia cerebrale diffusa a causa della perdita di neuroni coline­rgici prima nell’i­ppo­campo e poi della corteccia cerebrale. Terapie:
1) sommin­ist­razione di NGF per il modello di tratta­mento in animali => Effetti benefici:
- Protezione dei neuroni coline­rgici dopo una axotomia;
- Reversione dell’a­trofia legata all’in­vec­chi­amento;
- Migliora memoria e appren­dim­ento.
2) Trial clinici con NGF come proteina ricomb­inate (rNGF): sommin­istrata per via centrale.
3) Delivery Genico: Vettori virali (retro­virus di Moloney) ex vivo => prelievo fibrob­lasti autologhi, trasdotti con retrovirus che esprime NGF, e reimpianto nel cervello del paziente. Risultato: aumento del metabo­lismo cellulare del glucosio e formazione di neuroni coline­rgici => Minore declino cognitivo.
4) Studio in fase 1 con il CERE-110: Risultati => non funziona! C'è un bias sulle metodiche di sperim­ent­azione.

Dovuto alla predita di neuroni dopami­nergici della sostanza Nigra.
4 possib­ilità di terapia genica:
AAV: trasdurre geni che aumentino la dopammina: attività dopami­nergica aumentata, sui sintomi non ci sono miglio­ram­enti;
Interf­erire con l’aggr­ega­zione proteica;
Produzione e delivery di fattori neurot­rofici;
AAV-GAD: introd­ucono geni che producono GABA per regolare l'at­tività dei nuclei sotto-­tal­amici. L'enzima GAD produce i GABA.
Fase1: iniezione unilat­erale di AAV-GAD. Risultati => riduzione di assunzione di Levodopa e miglio­ramento bilate­rale!
Fase 2 : Iniezione bilate­rale, valuta­zione sicurezza e metabo­lismo dei neuroni.

TET-ON e TET-OFF:
TET-off: ci sono due vettori:
1. Ha tTA (trans­att­iva­tore) fuso a VP16 (espre­ssione costit­utiva);
2. Ha il gene terape­utico legato ad un promotore artifi­ciale che è formato in parte è CMV e per il resto lega l'op­eratore tTETO.
Nel sistema quando non c’è tetrac­iclina tTA libero si lega a tetO e lo esprime; in presenza di tetrac­iclina lega tTA impede­ndogli di legare l’oper­atore => l’espr­essione non avviene;
TET-on: ci sono di nuovo i due vettori con le stesse caratt­eri­stiche ma con un controllo inverso => se c’è tetrac­iclina si lega a tTA e solo così tTA è capace di legarsi all’op­eratore e quindi il gene si esprime.

Terapie per lo scompenso cardiaco
Obbiettivo: neo-ri­vas­col­ari­zza­zione di un arto o cuore ischemico.
Sperim­ent­azione animale: Modello di cane instru­mentato con un occlusore idraulico nelle corona­rie.Nella regione irrorata da quella coronaria così come in una regione più remota sono posizi­onanti dei cristalli piezoe­let­trici. Il loro movimento è monito­rabile => registra parametri fisiol­ogici. Si induce un piccolo infarto al cui bordo è state iniettato AAV di controllo o esprimenti con VEGF. Si monitora la contra­ttilità del cuore e, in presenza di una zona infart­uata, si ha l’allo­nta­namento dei 2 cristalli in sistole => shortening negativo. In animali trattati con VEGF => ripresa della contra­ttilità fino all’80%. => Effetto diretto sui miocar­diociti.
Studiando i recettori di VEFG, in modelli animali, si è visto che iniettando AAV con il recettore VEGFb si è in grado di ripris­tinare e prevenire lo scompenso cardiaco.

Difetti della Serca2a=> aumento di calcio porta a contra­zione meno efficace, soluzioni possibili:
Inibizione del fosfol­ambdano => inibisce l’ATPasi SERCA2a
Indurre una maggiore espres­sione della pompa SERCA2a: con AAV1 => non funziona!
Modula­zione dell’a­ttività β-adre­nergica (più adrenalina più rilascio di calcio)
Esprimere proteine che possano avere un effetto cardio­-pr­ote­ttivo (VEGF e IGF1).

Terapia genica per la rigene­razione del cuore
I miocar­diociti hanno un minimo potenziale rigene­rativo che potrebbe essere riatti­vato, dopo il suo spegni­mento nella 1° settimana di vita. (Studi con C14)
I miRNA sono down (o up) regolati in seguito a scompenso cardiaco, e regolano la capacità prolif­erativa dei miocar­diociti durante lo sviluppo. Esistono marker di prolif­era­zione cellulare: miR199a e miR590 eviden­ziati con EDu e l’α-ac­tinina in topo. Aurora B è un marker di citoch­inesi. In vettori che usano miRNa ai bordi di zone infartuate => si preserva funzione e la struttura, quindi rigene­raz­ione.
Target dei miRNA: silenziano simult­ane­amente geni per proteine di assemb­laggio della struttura sarcom­erica e citosc­hel­etrica.
Disass­emblare il sarcomero => segnale che elimina l’hippo pathway.
Esperi­menti su maiale: Quelli che hanno ricevuto AAV che esprime il miRNA dopo l'in­farto hanno un cuore relati­vamente normale (lievi aree ipocin­etiche) ma dopo due settimane presentano aritmia o cluster di cellule prolif­eranti causa => espres­sione di miRNA per lungo tempo => de differ­enz­iamento delle cellule cardiache che hanno sviluppato delle strutture simili a tumori.
Quindi si pensa ora di sommin­istrare i miRNA come minis, cioè piccole molecole più sicure: in piccoli animali funzionano (restano per 12 giorni).

Patologia X-Liked dovute alla mancanza o al malfun­zio­namento di alcune delle proteine della coagul­azione. Due forme:
Emofilia A: dovuta a un difetto del gene che codifica per il Fattore VIII.
Emofilia B: dovuta a un difetto del Fattore IX.
Terapia sostit­utiva: trasfu­sione di sangue.
Terapia genica: Basta una correzione del 10-50% per ristab­ilire il fenotipo normale. Vettore di scelta: AAV: il fattore 8° è troppo grande per essere inserito, ma per il 9° va bene. Se iniettato nel muscolo il fattore 9° porta ad aumento di sintesi di fattore 9° a livello locale; ma non avviene ciò nel fegato a causa di ab-anti AAV che causavano infiam­mazione epatica.
 
In pazienti con emofilia B severa trattati con AAV8, nel fegato, e usando vettori scAAV(self comple­mentary AAV), ed un fattore IX-codon optimized cioè con più proteina e più stabile rispetto alla wt, si è riscon­trato nel tempo un’esp­res­sione tra il 2 ed il 11%. Nel 2014 i 6 soggetti sono liberi dalla terapia sostit­utiva.
 
Si sono fatti anche studi per l’emofilia A e si è sviluppato un sistema dove si elimina il dominio B del Fattore 8 che si può produrre e clonare nell’AAV 5 (che accomoda geni più grandi).

1) Atrofia Muscolare Spinale (SMA): Malattia genetica data dal gene SMN (Survival Motor Neuron) presente in due tipi di copie: SMN1 (telomero) e SMN2 (centr­omero).
SMN1 codifica per la proteina SMN, essenziale per la soprav­vivenza e il normale funzio­namento dei motone­uroni.
I pazienti affetti da SMA hanno un numero variabile di copie di un secondo gene, SMN2, codifica per una forma accorciata della proteina SMN, con funzio­nalità ridotta al 10%. Il n° di copie del gene SMN2 è alla base della grande variab­ilità della patologia. Tipologie:
- Tipo 1: solo 2 copie di SMN sano: 15% di SMN funzio­nante, è la forma più grave.
- Tipo 2: Hanno maggiori quantità di SMN e quindi presentano varianti meno severe della condiz­ione.
- Tipo 3 e 4: In età adulta, hanno più proteina, è la forma meno grave.
Terapie con vettori virali:
AAV9 buoni risultati, ma aumento degli enzimi epatici dato da AAV, che può essere contro­llato;
Oligon­ucl­eotide anti-senso: Nusinersen interf­erisce con lo splicing della proteina SMN2 => aumenta la proteina funzionale con buoni risultati in tutte le forme.
NB: entrambe sono terapie che alleviano i sintomi ma non guaris­cono.
 
2) Sclerosi laterale amiotr­ofica (SLA): Malattia sporadica che determina degene­razione dei motone­uroni sia superiori, che inferiori. Il decorso di questa patologia può essere rallentato dal tratta­mento con farmaci glutam­mat­o-b­loc­canti (riluzolo) ma funziona poco o nulla. Il 10% delle forme sono genetiche dominanti e il gene mutato è l’enzima supero­ssido dismutasi 1 (SOD1). Questo ha 3 isoforme: SOD1 citopl­asm­atica;2 mitoco­ndr­iale;3 esterna alla cellula. In topi knock-in si osserva una gain-o­f-f­unction del gene e sintom­ato­logia SLA-like. Terapie:
In topi VGF𝛿 𝛿 si hanno sintomi SLA-like, ed esprimono meno VGF a livello spinale. Ottenuti con delezione in una regione sensibile all’ip­ossia di VEGF. => No difetti vascolari! La sommin­ist­razione di AAV-VEGF prolunga la vita del topo sia per un’ini­ezione intram­usc­olare ché per via intra-­cer­ebr­o-v­ent­ric­olare. In genere ogni neurone termina con una giunzione neurom­usc­olare, ma il VEGF dà origine a multiple giunzioni neurom­usc­olari. Con il VEGF pare che queste si stabil­izzano a seguito di iper-s­pro­uting assonale.

Oncogene: è un gene che porta la cellula verso lo sviluppo di un fenotipo neopla­stico
Oncoso­ppr­essore: è un gene che codifica per prodotti che agiscono negati­vamente sulla progre­ssione del ciclo cellulare, proteg­gendo la cellula dall'ac­cumulo di mutazioni potenz­ial­mente tumorali.
Cancer gene atlas: ha mappato circa 200 geni coinvolti nella trasfo­rma­zione neopla­stica.
Si può agire su:
Sulla cellula tumorale modifi­candole dirett­amente, compresi i meccanismi che la trasfo­rmando cellula tumorale. Tramite:
a) inibizione della prolif­era­zione,
b) trasfe­rendo geni suicidi in queste,
c) sfruttando virus oncolitici.
Le prospe­ttive non sono troppo incora­ggi­anti.
Sul SI Attiva­ndolo contro il tumore, e contra­stare la crescita delle cellule cancerose (immuno­-ge­ne-­therapy). Si fa con:
a) aumento della stimol­azione antigenica da parte del cancro,
b) aumentare la risposta delle cellule T citoto­ssiche
c) Modificare le cellule T citoto­ssiche effettrici attive contro le cellule tumorali.
Attivando il SI si può aspirare in un’immuno­terapia dei tumori.
Sulle cellule staminali ematop­oie­tiche trasfe­rendo in queste i geni che riducono la tossicità della chemio­ter­apia. Per aumentare l’indice terape­utico della chemio­ter­apia.

Primi tentativi : attiva­zione di oncoso­ppr­essori o inatti­vazione gli oncogeni. => Prima con oligontd naive dove si blocca la sintesi di un gene alterato, che altrimenti attive­rebbe il ciclo cellulare.
=> Poi si sono usati oligontd fosfot­ioati modificati con sostit­uzione di un ossigeno con uno zolfo per impedirne la degrad­azione.
=> Poi con LNA (morfolino => knockout in zebrafish) o PNA
Risultatom => 0! Sevono molti oligontd per bloccare gli mRNA di un gene alterato.

Ribozimi: struttura a RNA, attività enzima­tica, si associano a mRNA lo tagliano e lo distru­ggono. Due tipi:
1. Hammerhead : Si possono associare a qualsiasi sequenza per la quale siano proget­tati.
2. A forcina: Funzionano in modo analogo agli Hammerhead (struttura 3D poco più comple­ssa).
=> Si sono sviluppati per la Leucemia Mieloide Cronica ma sono stati rimpia­zzati dal Gleevec che inibisce la chinasi ibrida Bcr-Abl.

iRNA: sistema endogeno di silenz­iamento degli RNA.

Pro drug therapy: con profarmaci sfrutta il meccanismo dell’H­erpes simplex. I farmaci si attivano con la timidina kinasi, presente nelle cellule infette, tramite fosfor­ila­zione. => è incorp­orato nella catena nascente del DNA e porta la cellula alla morte. => non fa niente alle cellule sane, ma uccide selett­iva­mente quelle infettate dal virus.(prof­armaco: Gancic­lovir=> funziona in topo ma non in uomo => effetto by-stander: respon­sabile della replic­azione tumorale in animali, le cellule infettate che muoiono rilasciano metaboliti tossici che entrano nelle cellule vicine. => effetto positivo in topo, ma non è presente nell'uomo!

Virus Oncolitici Si è visto che in soggetti con tumore in un certo stadio, se contra­evano patologie virali e poi guarivano, erano anche guariti dal tumore! => Si può usare dirett­amente il virus per uccidere il tumore! Funzionano bene associati a chemio­ter­apia.
Uso di Adenovirus: esprime E1A (ma non E1B). Nei tumori p53 non è attivo => ciclo replic­ativo del virus = morte cellule tumorali, il virus si diffonde ad altre ( nelle sane invece p53 è attivo e si induce apoptosi)
ONYX015: iniettato in modo intrat­umorale e privo di E1B => effetto citopatico selettivo per le cellule p53 negative.

Immuno­terapia dei Tumori: poco efficace
Target: cellule tumorali; rafforza il SI
Sfrutta: Tal (che fanno homing nel tumore) => per tumori metast­atici
Meccan­ismo: aumento prolif­era­zione dei linfociti, esposi­zione ad antigeni di superficie tumorali specifici.
Tipologia: Attiva stimol­azione diretta del SI => DNA Vaccin­ation: sia risposte umorali, sia citoto­ssiche. Usa Gene Gun
Vettore di scelta: Adenovirus genoma abbastanza grande in cui può essere facilmente introdotto il gene terape­utico. Quelli di 1° e 2° gen sono usati per far esprimere gli antigeni tumorali o stimolare risposta del SI con citoch­inine (stimolano la prolif­era­zione dei linfociti)

Ignegn­eri­zzare Linfociti T citoto­ssici
I linfociti t hanno un antigene per TCR, funziona in associ­azione al CD3 => attiva la chinasi ZAP70 => segnale di attiva­zione della risposta linfoc­itaria.
Si crea la molecola artifi­ciale Car che permette a tutti i linfociti di targettare i tumori. Struttura della Car:
1) esterno ha il dominio di ricono­sci­mento dell'an­tigene tumorale
2) interno il sistema di segnal­azione ZAP70
Vettore: Virus lentiv­ira­li/­ret­rovirus che esprimono Car per Linfociti T citoto­ssici.
Risultato: Buono se il tumore esprime molti antigeni specifici!